PGT - monogenní choroba (PGT‑M)

Preimplantační genetické testování monogenních chorob u embryí metodou karyomapping (SNP array) s cílem určit jejich genotyp a vyšetřit aneuploidie. Embrya nesoucí genotyp spojený s rozvojem genetického onemocnění, nebo odchylku v počtu chromozomů nejsou doporučena k transferu.

Vyšetření PGT metodou karyomapping probíhá v několika fázích. Vstupním vzorkem je 5-10 buněk trofektodermu odebraných 5. – 6. den vývoje embrya ve stádiu blastocysty. Buňky jsou nejprve zlyzovány a uvolněná DNA je amplifikována metodou celogenomové amplifikace na prinicipu MDA. Dalším krokem je analýza DNA pacientky a příbuzných spolu s amplifikovanou DNA embryí s využitím technologie SNP array. Pomocí detekce fluorescence na speciálním čipu je možné stanovit nukleotidové složení a tím i genotyp u jednotlivých značek (SNP) na přesně definovaných pozicích v genomu člověka. K analýze se využívá přibližně 700 000 SNP rovnoměrně pokrývajících všechny chromozomy a celý genom. Vyhodnocením intenzity fluorescence ve dvou kanálech u všech SNP na čipu se získá informace o genotypu a vzájemném poměru alel v rámci jednotlivých SNP i celého genomu. SNP alely jsou přenášeny z rodičů na potomstvo na principu medelistické dědičnosti. V poslední fázi jsou získaná SNP data digitálně vyhodnocena sérií aplikací s cílem určit genotyp embrya ve vyšetřovaném genu a stanovit u embrya počet kopií všech chromozomů, nebo jejich částí.

Genotypizace embryí probíhá metodou nepřímé genetické diagnostiky, kdy se místo samotné mutace vyšetřují SNP markery, které jsou s ní ve vazbě (na jednom vlákně DNA). Sestavu všech SNP markerů ve vazbě s mutantní, nebo normální alelou nazýváme haplotyp. Genotypem embrya se rozumí kombinace haplotypů, které reprezentují mutantní, nebo normální alelu vyšetřovaného genu a jsou s ní ve vazbě. Délka haplotypu a počet SNP markerů ve vazbě s konkrétní alelou se u každého embrya liší v závislosti na pozicích crossing overů. Diagnostická spolehlivost stanovení genotypu embrya v rámci PGT-M tímto způsobem je velmi vysoká (> 99,5 %) a kompenzuje riziko ADO (alelický drop-out) u vyšetření velmi malého množství DNA z několika buněk odebraných z embrya.

Vyšetření aneuploidií u embryí probíhá současně s genotypizací pomocí celogenomové analýzy SNP. S využitím vzorků DNA od matky a otce zařazených do vyšetření je možné u aneuploidií chromozomů, nebo jejich částí zjistit, zda je aneupoidie u embrya meiotická (původem z vajíčka, či spermie), nebo je původu mitotického a došlo k ní až po vzniku zygoty během raného embryonálního vývoje. Za neživotaschopné se považují aneuploidie meiotického původu, protože se s největší pravděpodobností vyskytují u všech buněk a embrya a nejsou slučitelné s dalším vývojem plodu ve zdravého jedince.

Vyšetřovaná embrya jsou doporučena, či nedoporučena k transferu na základě kombinace výsledku genotypizace embrya s vyšetřením aneuploidií, a to v souladu s genetickou indikací k vyšetření, která reflektuje typ dědičnosti, závažnost projevů a riziko rozvoje dědičného onemocnění asociované s genotypem embrya.